定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室瑞士羅氏公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler 480Ⅱ）已開(kāi)放預(yù)約，LightCycler 480Ⅱ儀器配有一個(gè)溫控模塊單元，可容納 96 孔，五個(gè)激發(fā)濾光片和六個(gè)發(fā)射濾光片隨意組合能使熒光基團(tuán)得到最佳激發(fā)，并且熒光基團(tuán)發(fā)射的信號(hào)能得到精確地測(cè)量。

二、應(yīng)用范圍：

熒光定量PCR主要應(yīng)用在定量和基因分型，定量又包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量。

1.絕對(duì)定量分析中目的基因的濃度表達(dá)為絕對(duì)濃度，例如拷貝數(shù)，微克或微摩爾，通過(guò)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，而拿到未知樣品的濃度，常用領(lǐng)域包括細(xì)菌、病毒的研究。

2.相對(duì)定量通常用于基因表達(dá)的研究，絕對(duì)的濃度并不重要，通常以目的基因與參比基因的相對(duì)濃度比值來(lái)表達(dá)結(jié)果，也可以引入校準(zhǔn)樣品，來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化的處理，結(jié)果也可以選擇性的進(jìn)行PCR效率校正，使其更加精確。相對(duì)定量中還經(jīng)常引入校準(zhǔn)品的概念，也就是使用校準(zhǔn)品對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行歸一化的處理，未知樣本的相對(duì)濃度除以較正樣本的相對(duì)濃度即是歸一化的相對(duì)濃度，這對(duì)不同批次的實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)穩(wěn)定的較正點(diǎn)，從而使實(shí)驗(yàn)人員能夠?qū)Σ煌瑫r(shí)間、不同批次的多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正。

3.基因分型包括終點(diǎn)法和熔解曲線法。對(duì)于已知突變位點(diǎn)的基因分型，使用水解探針做終點(diǎn)檢測(cè)，也可以使用雜交探針或簡(jiǎn)單探針?lè)ㄈ劢馇�線的分析，對(duì)于新突變位點(diǎn)的篩選，比如SNP、缺失或者插入，相對(duì)于目標(biāo)基因的特定區(qū)域，則使用飽和熒光染料對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。

終點(diǎn)法基因分型使用兩條序列特異性的探針，一條針對(duì)野生型、一條針對(duì)突變型，用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)終止時(shí)的熒光信號(hào)檢測(cè)來(lái)判斷基因型。

基于熔解曲線的序列分析主要有3種，一種是通過(guò)SYBR Green I來(lái)進(jìn)行產(chǎn)物特異性的鑒定，二是使用飽和染料來(lái)做高分辨率掃描，三是熒光標(biāo)記雜交探針來(lái)做基因分型。

4.高分辨熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting）簡(jiǎn)稱HRM，是近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外興起的一種用于突變掃描和基因分型的較新的遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的 PCR 技術(shù)，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無(wú)需序列特異性探針，在 PCR 結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對(duì)樣品突變、單核苷酸多態(tài)性-SNP、甲基化、基因分型等分析。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例

1.DNA或RNA的絕對(duì)定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等。

2.基因表達(dá)差異分析，比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異。

3.終點(diǎn)法基因分型的原理是2條水解探針，分別特異性地識(shí)別、結(jié)合野生型和突變性目標(biāo)DNA區(qū)域，并用不同染料標(biāo)記。例如SNP檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。

4.HRM的主要原理是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析。它是對(duì)傳統(tǒng)熔解曲線分析的延伸，其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分。

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